Tas film TPX
Film TPX, tipe kotor dengan ketebalan 50 µm, diperoleh dari Fuji Chemi Trading Co., Ltd (nama produk Opulent, https://www.ftcj.co.jp/en_products/lp/release/). Dua lembar film ditumpuk, dan tiga sisinya disegel panas untuk membuat kantong. Ukuran ruang kultur disiapkan dengan menutup kantong dengan klip plastik atau perlakuan panas (lihat Video Tambahan 1) untuk memberikan ca. 52 × 74mm (untuk E.coli Dan Basil sp.) atau ca. 100 × 241 mm (untuk ragi). Volume sedang adalah 2 mL untuk kantong 52 × 74 mm dan 12,5 mL untuk kantong 100 × 241 mm (0,052 mL cm-1).–2 dari jejak tas). Kantong film disterilkan dengan autoklaf (121 °C, 1 atm, 20 menit).
Strain
Yang belum berubah Escherichia coli DH5α, strain Rosetta (DE3) membawa plasmid kosong pET28a(+) dan Komagataella phaffii (X-33) digunakan sebagai organisme model. Basil sp., diduga Bacillus amiloliquefacience15dikultur sebagai organisme pembentuk biofilm.
Kultur dari inokulum kultur suspensi E.coli DH5α
Sel dipra-kultur selama 5 jam (fase pertumbuhan logaritmik) menggunakan 5 mL media LB atau TB dalam tabung polipropilen (3181–345, 27 mm id, Labcon) dengan kultur kocok cair (37 ° C, 180 rpm, diameter pengocokan, 2,5 cm). Dua mililiter pra-kultur ini disuspensikan dalam 300 mL masing-masing media yang sesuai, dan 2 mL resuspensi sel ini dipindahkan ke tabung baru (3181–345) dan kantong film TPX. Tabung dikocok pada suhu 37 °C, 200 rpm, dan kantong film TPX diatur secara statis pada suhu 37 °C. Kekeruhan diukur setiap 1 jam dengan mengukur serapan pada 600 nm (OD600).
Budidaya dari koloni E.coli DH5α
Untuk pengamatan pertumbuhan dari koloni yang diinokulasi langsung, koloni dikembangkan dari stok beku dengan cara disebarkan pada cawan LB yang mengandung agar 1,5% dan dikultur pada suhu 37 °C selama 16 jam. Tiga koloni dipilih secara acak dan disuspensikan dalam 300 mL medium LB. Kekeruhan suspensi ini diukur sebagai kekeruhan awal (“Inoc”). Dua mililiter suspensi segar dipindahkan ke tabung baru, 3181–345, dan kantong film TPX. Tabung dikocok pada 200 rpm, dan kantong film TPX ditempatkan pada suhu 37 °C selama 1 jam.
Produksi plasmid oleh E.coli Rosetta (DE3)
Escherichia coli Sel Rosetta (DE3) yang mengandung plasmid pET28a(+) dikultur dari koloni menggunakan kondisi yang sama seperti dijelaskan di atas, kecuali media LB mengandung 50 µg mL-1.–1 kanamisin dan kloramfenikol. Sel-sel dipanen dari 1 mL kultur dengan sentrifugasi pada 3000 g dan 5 ° C selama 30 menit. Pelet sel disuspensikan dalam 200 μL buffer (50 mM Tris-HCl dan 10 mM EDTA, pH 7,5), dan sel dilisiskan dengan menambahkan 200 μL larutan lisis (0,2 M NaOH dan 1% SDS) diikuti dengan pencampuran 400 μL netralisasi. larutan (1,25 M kalium asetat dan 1,25 M asam asetat glasial). Supernatan dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 18.000 g, 5 °C selama 10 menit dan diolah dengan RNaseA dengan menambahkan 1 μL dari 10 μg mL-–1 larutan stok larutan dan diinkubasi pada suhu 65°C selama 30 menit. Setelah ekstraksi menggunakan fenol:kloroform:isoamil alkohol (25:24:1) dan sentrifugasi pada 18.000 g, 5 °C selama 10 menit, DNA diendapkan menggunakan volume setara 2-propanol dengan 0,1 volume natrium asetat 3 M dengan sentrifugasi pada 18.000 g, 5 °C selama 5 menit, lalu dicuci menggunakan etanol 70%. Setelah sentrifugasi pada 18.000 g, 5 °C selama 5 menit, pelet dikeringkan dalam ruang hampa dan dilarutkan dalam jumlah yang sesuai yaitu 10 mM Tris–HCl (pH 8,0) dan 1 mM EDTA･Na2 penyangga. Kuantitas DNA diukur menggunakan instrumen NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd).
Komagataella phaffii (X-33) budaya
Ragi dikultur dalam media Buffered Glycerol-complex Medium (BMGY) dan Buffered Methanol-complex Medium (BMMY) mengikuti Panduan Pengguna Pichia Expression Kit yang disediakan oleh Invitrogen, Co. Ltd. Yeast Nitrogen Base (YNB) disiapkan dengan BD Difco YNB tanpa asam amino (BD 291.940). Koloni diinokulasi dalam 30 mL media BMGY dalam labu penyekat 300 mL dan dikultur pada 200 rpm dan 37 °C sebagai pra-kultur. Setelah 19 jam, sel-sel yang dikultur dipanen dengan cara sentrifugasi (1500 g, 25 ° C selama 5 menit) dan diresuspensi dalam media BMMY untuk menyesuaikan OD.600 hingga ~ 1,0 untuk menghasilkan suspensi BMMY. Kemudian, 12,5 mL suspensi BMMY ini dipindahkan ke labu penyekat 125 mL (1-8773-06, Thermo Fisher Scientific, Co. Ltd), dan sel dikocok pada 200 rpm sebagai kontrol. Volume suspensi BMMY yang sama dipindahkan ke FB. Suhu kedua budaya diatur ke 30 °C. OD600 diukur setelah 24 jam.
Budaya dari Basil sp. dan pewarnaan periodik acid-Schiff (PAS).
Stok beku Basil sp. disuspensikan dalam 100 mL medium (30 g L–1 pepton kedelai, 10 g L–1 glukosa, 1 g L–1 KH2PO40,5 gram L–1 MgSO4·7 jam2O, pH 6) dan 2 mL suspensi ditempatkan ke dalam kantong film TPX. Kantong ditempatkan secara statis pada suhu 24 ° C selama 48 jam. Semua tepi tas dipotong, dan setiap film yang terpisah dicuci dengan hati-hati dengan air. Zat-zat yang menempel sepenuhnya ternoda oleh film. Film ditempatkan dalam larutan asam periodik (1%) selama 10 menit dan dicuci dua kali dengan air. Film kemudian ditempatkan dalam reagen Schiff (191-08441. Wako Co., Ltd) selama 10 menit. Film dibilas tiga kali dengan larutan natrium bisulfit-HCl (52 mM natrium bisulfit dan 45 mM HCl) masing-masing selama 3 menit dan kemudian dicuci dengan air keran.
Kekeruhan
Kekeruhan suspensi sel diukur pada 600 nm setelah pengenceran yang sesuai dengan media segar (lihat Informasi Tambahan 2) menggunakan spektrofotometer (UV1280, Shimadzu Co. Ltd).
Statistik
Signifikansi ditentukan oleh a T-uji menggunakan fungsi “T.TEST” di Microsoft Excel. Tes ini dilakukan sebagai sampel Siswa berpasangan dua sisi T-uji dengan varian yang tidak sama. Deviasi standar ditunjukkan pada gambar.
